Primeramente, para efectuar una tinción, lo que debemos tener son microorganismos sembrados. Dichos microorganismos los hemos el día previo mediante la técnica de siembra de estría múltiple, los hemos dejado incubar a lo largo de 24 horas a 37ºC en la incubadora para de esta forma obtener las colonias de los distintos microorganismos. La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio desarrollada por Christian Gramen el año 1884.
Los representantes mucho más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. El lugol está formado por I2 en equilibrio con KI , el cual está presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. Tras agarrar la exhibe de bacterias que deseamos teñir con un isopo procederemos a extenderla en un portaobjetos y a secarla o dejándola secar a temperatura ambiente o con un encendedor, de manera cuidadosa de no abrasar las bacterias. El siguiente paso es fijar la exhibe en el portaobjetos mediante la app de metanol durante un minuto.
Procedimiento Tinción De Gram
La pared celular de las bacterias grampositivas y gramnegativas es permeable al violeta cristal. No obstante, la de las primeras no es así al complejo de yodo y colorante formado dentro de la célula. La pared celular de las bacterias grampositivas, en contraste a la de las gramnegativas, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos tras tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la área externa de la pared celular, y el disolvente suprimirá sin contrariedad el complejo formado tras el régimen con yodo. Más tarde se aplica el tinte de violeta de genciana, además habitual como cristal violeta, al portaobjetos y se deja descansar un minuto.
Los estudiosos emplearon en sus trabajos una bacteria Gram-negativa muy conocida, la Escherichia coli. Tras añadir el colorante observaron un pico brusco de la señal conforme el colorante se alineaba con la membrana externa, y después una disminución en el momento en que llegaba al espacio entre las membranas, donde las moléculas tenían mucho más independencia para desplazarse. Observaron un segundo pico al alinearse en la membrana interior pero, en lugar de la disminución de señal que aguardaban porque se suponía que el colorante pasaba al interior de la célula, se encontraron con que la señal se mantenía incesante. Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una manera u otra.
Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte. La tinción de Gram también puede realizarse tras un cultivo, en el que se hace medrar a las bacterias en el laboratorio en un medio con nutrientes. En estos casos, la tinción de Gram permite determinar el género de bacteria presente y contribuye a elegir otras pruebas de laboratorio que permiten identificar finalmente la causa de la infección.
Para finalizar, aplicamos a la exhibe la safranina y lo dejamos accionar a lo largo de otro minuto. En este momento vamos a añadir el lugol justo sobre la zona de la muestra y esperamos otro minuto. Abrimos la placa con las bacterias y con el asa tocamos en el agar para revisar que este está frío.
De Qué Forma Hacer Una Tinción De Gram Y Su Fundamento
Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en entre los dos grupos. Frecuentemente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, al tiempo que las Gram positivas continúan azules.
Sin embargo, la de las primeras no es así al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la célula. La pared celular de las bacterias grampositivas, a diferencia de la de las gramnegativas, sería prácticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecerán teñidos tras tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la área externa de la pared celular, y el disolvente eliminará sin contrariedad el complejo formado después del tratamiento con yodo. Entonces se enjuaga la exhibe con agua y se aplica lugol, de forma que cubra toda la exhibe y se estima en el transcurso de un minuto.
Con la tinción de Gram lo que estamos detectando es esencialmente el tipo de pared celular de la bacteria que nos encontramos examinando en ese momento. La tincin de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaos, morfologas celulares y reaccin Gram . A nivel del laboratorio es til como test para un rpido diagnstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en desarrollo, y adicionalmente se utiliza para apreciar la calidad de la muestra clnica. Las bacterias se tien gram positivas (+), gram negativas () o no se tien gracias a sus diferencias en la composicin de su pared y arquitectura celular. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, es porque la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La cubierta de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para lograr retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó antes, y en consecuencia este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea.
Este colorante puede atravesar cualquier clase de pared bacteriana con lo que tiñe tanto bacterias gram positivas como gram negativas. La contratinción, no obstante, no se aprecia en bacterias grampositivas debido a la tinción violeta cristal mucho más obscura. El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gramnegativas, los lípidos de la pared (mucho más rebosantes que en las células grampositivas) se disuelven por este régimen, lo que deja el escape del complejo de cristal violeta con yodo.
No toman ningn color, siendo por norma general el fondo cerca de ellos de un ligero gram (-). Esta reaccin gram fué vista en tinciones de muestras clnicas en donde estn presentes elementos fngicos o algunas espcies de micobacterias. Por lo tanto, ambos géneros de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, puesto que es el material que otorga su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
Ciertos autores objetan esta teoría, pero es indudable la relevancia general de la pared celular. En la situacion de las bacterias gram positivas los complejos insolubles se quedan atrapados entre las capas de peptidoglicano de la pared bacteriana, sin disolver y dando la coloración morada característica al observarlas al microscopio. En cambio, en las bacterias gram negativas estos compuestos sí que se disuelven y pierden su color. Al microscopio se verán incoloras o de color rosa-rojo, en función de si se ha añadido la fucsina en el final de la técnica de tinción de Gram. Las bacterias gram negativas se observaran incoloras, de color rosa o rojo, en función de si hemos efectuado el último paso opcional de la técnica de tinción de Gram. Un caso de exhibe de bacteria gram efectiva es Staphylococcus aureus y un caso de muestra de bacteria gram negativa es Escherichia coli.
Pasado el minuto pertinente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la manera anteriormente descrita. Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto mucho más. Una vez lograda una pequeña proporción de la muestra , lograr que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la que servirá para depositar la exhibe contenida en el asa. Los microbios de reacción efectiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por acrecentar la acidez. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún tras tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con sencillez el primer tinte, y toman el segundo.
Tiene una cubierta delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la exhibe con agua corriente. Para efectuar el lavado, se debe tomar en consideración que el chorro de agua NO debe caer de manera directa sobre la exhibe, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene exhibe. El chorro debe ser un chorro angosto, precisamente de medio a un centímetro de espesor.
Tinción De Contraste
La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es caracteristica de toda substancia viviente, sino se restringe casi en absoluto a hongos y bacterias. De esta manera observamos que las células de plantas y animales superiores no preservan la primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el colorante. La reacción de Gram no es eficaz ni constante; puede variar transcurrido un tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras causas. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram.